CRISPR和单细胞测序精确定位性状和疾病的因果遗传变异

人类遗传学的一个主要挑战是了解基因组的哪些部分驱动特定特征或导致疾病风险。对于在98%的不编码蛋白质的基因组中发现的遗传变异来说，这一挑战甚至更大。

纽约大学和纽约基因组中心的研究人员开发了一种新方法，将遗传关联研究、基因编辑和单细胞测序结合起来，以应对这些挑战，并发现血细胞性状的因果变异和遗传机制。

他们的方法被称为STING-seq并发表在《科学》杂志上，解决了将遗传变异与人类特征和健康直接联系起来的挑战，并可以帮助科学家确定具有遗传基础的疾病的药物靶点。

在过去的二十年中，全基因组关联研究(GWAS)已成为研究人类基因组的重要工具。使用GWAS，科学家们已经确定了数千种与许多疾病相关的基因突变或变异，从精神分裂症到糖尿病，以及身高等特征。这些研究是通过比较大量人群的基因组来进行的，以发现在具有特定疾病或特征的人群中更常发生的变异。

GWAS可以揭示基因组的哪些区域和潜在变异与疾病或性状有关。然而，这些关联几乎总是存在于98%不编码蛋白质的基因组中，这比经过充分研究的2%的编码蛋白质的基因组要少得多。更复杂的是，许多变异在基因组中彼此非常接近，并一起传播几代人，这一概念被称为连锁。这可能使得很难从附近的其他变体中梳理出哪个变体起着真正的因果作用。即使科学家能够确定哪个变异导致疾病或性状，他们也并不总是知道变异影响什么基因。

“人类疾病研究的一个主要目标是确定因果基因和变异，这可以阐明生物学机制并为这些疾病的药物靶点提供信息，”纽约大学生物学副教授，纽约大学格罗斯曼医学院神经科学和生理学副教授，纽约基因组中心的核心教员Neville Sanjana说， 以及该研究的共同资深作者。

“GWAS的巨大成功凸显了从这些海量数据集中提取疾病生物学见解的挑战。尽管我们在过去10年中做出了所有努力，但杯子仍然只有半满 - 充其量。我们需要一种新的方法，“纽约基因组中心高级副教员Tuuli Lappalainen说，他是瑞典KTH皇家理工学院基因组学教授，也是该研究的共同资深作者。

镰状细胞性贫血的治疗方法

最近在治疗镰状细胞性贫血(一种以剧烈疼痛发作为特征的遗传性疾病)方面取得的一项科学突破说明了如何将GWAS与基因编辑等尖端分子工具相结合，可以识别因果变异并导致创新疗法。使用GWAS，科学家们确定了基因组中对产生胎儿血红蛋白很重要的区域，这是一个基于其逆转镰状细胞性贫血的前景的靶标，但他们不知道哪种确切的变体推动了其产生。

根据Sanjana的说法，研究人员转向CRISPR(一种使用“分子剪刀切割DNA”的基因编辑工具)来编辑GWAS识别的区域。当CRISPR编辑在非编码基因组中靠近BCL11A的基因的特定位置进行时，它会导致高水平的胎儿血红蛋白。

CRISPR现已用于临床试验，以编辑数十名镰状细胞性贫血患者骨髓细胞中的该区域。在将修饰的细胞注入患者体内后，它们开始产生胎儿血红蛋白，从而取代突变的成人血红蛋白形式，有效地治愈了镰状细胞病。

“治疗镰状细胞病的这个成功故事是将GWAS的见解与基因编辑相结合的结果，”Sanjana说。“但只对一种疾病进行了多年的研究。我们如何扩大规模以更好地识别GWAS的因果变异和靶向基因?”

GWAS满足CRISPR和单细胞测序

研究小组创建了一个名为STING-seq的工作流程 - 使用单细胞测序系统靶向和抑制非编码GWAS位点。STING-seq的工作原理是采用生物银行规模的GWAS，并使用生化特征和调节元素的组合寻找可能的因果变异。然后，研究人员使用CRISPR靶向与GWAS有关的基因组的每个区域，并进行单细胞测序以评估基因和蛋白质表达。

在他们的研究中，研究人员说明了使用STING-seq来发现血液性状非编码变异的靶基因。血液特征(如血小板、白细胞和红细胞的百分比)在常规血液检查中很容易测量，并且在 GWAS 中得到了很好的研究。因此，研究人员能够使用代表来自不同背景的近750万人的GWAS来研究血液特征。

一旦研究人员确定了基因组中可能在血液特征中起作用的543个候选区域，他们就使用了一种称为CRISPR抑制的CRISPR版本，可以沉默基因组的精确区域。

在对GWAS识别的区域进行CRISPR沉默后，研究人员观察了单个细胞中附近基因的表达，以查看特定基因是否被打开或关闭。如果他们发现变异被沉默和未沉默的细胞之间的基因表达存在差异，他们可以将特定的非编码区域与靶基因联系起来。通过这样做，研究人员可以确定哪些非编码区域是特定性状的核心(哪些不是)，并且通常还可以确定这些非编码区域工作的细胞途径。

“STING-seq的力量在于我们可以将这种方法应用于任何疾病或性状，”纽约基因组中心和纽约大学的博士后助理，该研究的第一作者John Morris说。

使用STING-seq测试可能的变异簇并观察它们对基因的影响，消除了科学家以前在面对变异或最接近变异的基因之间的联系时遇到的猜测，这些变异通常是但并不总是目标基因。在称为单核细胞计数的血液特征的情况下，应用CRISPR导致一个基因CD52明显显着改变 - 虽然CD52接近感兴趣的变体，但它不是最接近的基因，因此可能被以前的方法忽略了。

在另一项分析中，研究人员发现了一种名为PTPRC的基因，该基因与10种血液特征有关，包括与红细胞和白细胞以及血小板相关的特征。然而，有几种GWAS鉴定的非编码变体非常接近，并且很难了解哪种(如果有的话)可以调节PTPRC表达。应用STING-seq使他们能够通过查看哪些改变PTPRC表达来隔离哪些变异是因果关系。

STING-seq 及以后

虽然STING-seq可以通过沉默变异来识别靶基因和因果变异，但它并不能解释效应的方向 - 特定的非编码变异是否会增加或减少附近基因的表达。研究人员将他们的方法更进一步，创造了一种他们称之为beeSTING-seq(碱基编辑STING-seq)的补充方法，该方法使用CRISPR精确插入遗传变异，而不仅仅是抑制基因组的该区域。

研究人员设想STING-seq和beeSTING-seq用于识别各种疾病的因果变异，这些疾病可以通过基因编辑(如镰状细胞性贫血)或靶向特定基因或细胞途径的药物进行治疗。

“现在我们可以将非编码变异与靶基因联系起来，这为我们提供了证据，证明可以开发小分子或抗体疗法来改变特定基因的表达，”Lappalainen说。

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